Büyük İskender’in ölümü üzerine (M.Ö. 323) Anadolu’da siyasi anlamda yeni bir süreç baş göstermiştir. Bu süreçte; Büyük İskender’in halefleri imparatorluğun birliğini sağlayamamış ve imparatorluk çeşitli krallıklara bölünerek dağılmıştır.
Bu gelişmeler yaşanırken M.Ö. 301 yılında Pers kökenli Mitridates Ktistes, Mitridates Krallığını kurarak Amasya’yı başkent yapmıştır.
Başkentin V. Mitridates Euergetes (150-120) döneminde Sinop’a nakledilmesine kadar uzun yıllar Mitridates Krallığının başkenti olarak kalmış olan Amasya’da, büyük bir imar faaliyeti başlamış ve özellikle Mitridates Eupator döneminde bu faaliyetle birlikte şehir bir kültür merkezi haline gelmiştir.
Bu dönemde; Mitridates Krallığı ile Roma İmparatorluğu arasında özellikle V. Mitridates zamanında gelişen iyi ilişkiler, Mitridates Eupator döneminde (M.Ö. 111-63) tersine dönmüş ve bunun sonucunda uzun yıllar süren Mitridates savaşları yaşanmıştır. En son M.Ö. 63 yılında Mitridates Eupator ile Romalı general Pompeius’un orduları arasında yapılan savaşta Eupator’un yenilmesi üzerine Amasya Roma askerleri tarafından işgal edilerek tahrip edilmiş Pompeius, Mitridates Krallığının egemenliğine son vererek topraklarını Bithynia bölgesiyle birleştirerek Bithynia-Mitridates Eyaletini oluşturmuş Amasya ve civarı Roma egemenliği altına girmiştir.
Mitridates Eupator’un oğlu olan Kırım Kralı II. Pharnakes, Roma İmparatorluğu içerisinde yaşanan iç savaşlar nedeniyle Mitridates Krallığının eski topraklarını bir süre geri almayı başarmış, fakat M.Ö. 47 yılında Zela (Zile) yakınlarında Caesar (Sezar) komutasındaki Roma birlikleriyle yaptığı savaşta yenilmesi üzerine, Amasya’nın da içinde bulunduğu topraklar tekrar Roma egemenliğine geçmiştir.